蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）活性測(cè)定：細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控者

蘋(píng)果酸脫氫酶（Malate Dehydrogenase，MDH，EC 1.1.1.37）是一類(lèi)廣泛存在于生物界的脫氫酶，在動(dòng)物組織、植物器官、微生物細(xì)胞及體外培養(yǎng)細(xì)胞中均有分布，是維持細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵酶之一。其酶促反應(yīng)具有明顯的亞細(xì)胞定位特異性：線粒體中的 MDH作為三羧酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）的核心酶組分，催化蘋(píng)果酸氧化生成草酰乙酸，為 TCA 循環(huán)的持續(xù)進(jìn)行提供關(guān)鍵中間產(chǎn)物；而胞漿中的 MDH則催化逆反應(yīng)，即草酰乙酸還原生成蘋(píng)果酸，二者協(xié)同維持胞內(nèi)蘋(píng)果酸與草酰乙酸的平衡。

草酰乙酸作為代謝網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)分子，不僅是 TCA 循環(huán)的關(guān)鍵中間物，還可通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用生成天冬氨酸，參與尿素循環(huán)、嘌呤合成及氨基酸代謝，同時(shí)也是糖異生途徑的起始底物之一。因此，MDH 的活性直接調(diào)控細(xì)胞內(nèi)能量代謝（線粒體氧化磷酸化）、蘋(píng)果酸 - 天冬氨酸穿梭系統(tǒng)（胞漿與線粒體間 NADH 的轉(zhuǎn)運(yùn)）、活性氧（ROS）清除（通過(guò)維持 NADPH/NADP + 平衡）及生物脅迫抗性（植物抗病、微生物抗逆）等多種生理過(guò)程，是評(píng)價(jià)細(xì)胞代謝狀態(tài)的重要指標(biāo)酶。

根據(jù)酶促反應(yīng)依賴(lài)的輔酶類(lèi)型，MDH 可分為兩類(lèi)：NAD - 依賴(lài)型 MDH（NAD-MDH） 和NADP - 依賴(lài)型 MDH（NADP-MDH） 。二者在分布上存在顯著差異：原核生物（如細(xì)菌）中通常僅含有 NAD-MDH，而在真核細(xì)胞中，NAD-MDH 主要分布于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和線粒體基質(zhì)中，NADP-MDH 則多存在于葉綠體（植物）、過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器中，本次實(shí)驗(yàn)聚焦于 NAD-MDH 的活性測(cè)定。

測(cè)定原理

基于 NAD-MDH 催化的可逆反應(yīng)特性，本次實(shí)驗(yàn)采用還原方向反應(yīng)進(jìn)行活性測(cè)定，即利用 NAD-MDH 催化草酰乙酸（底物）在 NADH（還原型輔酶）的參與下還原生成蘋(píng)果酸，同時(shí) NADH 被氧化為 NAD+（氧化型輔酶）。反應(yīng)式如下：

草酰乙酸 + NADH + H? → 蘋(píng)果酸 + NAD?

由于 NADH 在紫外光區(qū)（340nm 波長(zhǎng)）具有特異性光吸收（摩爾吸光系數(shù) ε=6220 L?mol?1?cm?1），而 NAD + 在該波長(zhǎng)下無(wú)明顯吸收，因此反應(yīng)過(guò)程中 340nm 處光吸收值的下降速率與 NAD-MDH 的活性呈正相關(guān)。通過(guò)紫外分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) 340nm 處吸光度的變化，根據(jù)吸光度下降速率即可計(jì)算出樣品中 NAD-MDH 的活性。

三、需自備的儀器和用品

為確保實(shí)驗(yàn)順利開(kāi)展，需提前準(zhǔn)備以下儀器設(shè)備及耗材，所有儀器需在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行校準(zhǔn)，耗材需經(jīng)無(wú)菌處理（如需測(cè)定無(wú)菌樣品）或清潔處理，避免雜質(zhì)干擾酶促反應(yīng)：

紫外分光光度計(jì) / 酶標(biāo)儀：需具備 340nm 波長(zhǎng)檢測(cè)功能，支持連續(xù)監(jiān)測(cè)（動(dòng)力學(xué)模式），分光光度計(jì)需配套石英比色皿適配的比色池，酶標(biāo)儀需支持 96 孔板（建議為紫外透明板，如石英材質(zhì)或?qū)Ｓ米贤?96 孔板）檢測(cè)，分辨率不低于 0.001 Abs。

臺(tái)式離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速不低于 12000×g，支持 4℃低溫離心（用于樣品勻漿后的沉淀去除，避免蛋白雜質(zhì)干擾），需配備 1.5mL 或 2mL 離心管適配轉(zhuǎn)子。

恒溫水浴鍋：溫度控制精度 ±0.5℃，可穩(wěn)定維持反應(yīng)溫度（通常為 30℃或 37℃，具體根據(jù)物種最適溫度調(diào)整），需提前預(yù)熱至設(shè)定溫度。

2. 樣品處理與加樣工具

可調(diào)式移液器：量程覆蓋 10μL~1000μL（建議配備 10μL、100μL、1000μL 三種規(guī)格），需配套相應(yīng)規(guī)格的無(wú)菌吸頭（低吸附吸頭優(yōu)先，減少酶蛋白吸附損失），使用前需校準(zhǔn)移液精度。

微量石英比色皿 / 96 孔板：若使用分光光度計(jì)，需準(zhǔn)備光程為 1cm 的微量石英比色皿（容積約 500μL~1mL），石英材質(zhì)可避免紫外光吸收干擾；若使用酶標(biāo)儀，需選擇紫外透明 96 孔板（不可使用普通塑料板，其會(huì)吸收 340nm 紫外光），建議為平底設(shè)計(jì)以保證檢測(cè)一致性。

蒸餾水：需為超純水（電阻率≥18.2 MΩ?cm），用于配制緩沖液、稀釋樣品及清洗儀器，避免離子或有機(jī)物污染影響酶活性。

其他輔助耗材（根據(jù)樣品類(lèi)型準(zhǔn)備）：如組織勻漿器（用于動(dòng)物 / 植物組織樣品破碎）、無(wú)菌離心管（1.5mL/2mL）、移液器吸頭盒、一次性手套、無(wú)塵紙等。